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不同采收期的附子中三种乌头碱的含量比较
不同采收期的附子中三种乌头碱的含量比较【摘要】 目的 考察不同采收时间的附子中新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的含量。方法 采用高效液相色谱法进行测定，色谱柱为Diamonsil C18柱（150mm×4.6mm,5μm）；流动相A:乙腈-四氢呋喃（25:15）；流动相B:0.1mol/L醋酸铵溶液，检测波长：λ=235nm;流速：1ml/min;柱温：25℃。结果 不同采收时期附子中三种乌头碱的含量发生了明显变化，随着时间（7 —— 9月份）的推移，新乌头碱的含量呈下降趋势，次乌头碱、乌头碱的含量呈上升趋势。结论 此方法简单、易行，可为附子的进一步研究提供科学依据。
【关键词】 附子；新乌头碱；次乌头碱；乌头碱；高效液相色谱法
[Abstract] Objective To study the content mensuration of Hypaconitine,Mesaconitin and Aconitine of Aconite root in different period of harvest.Methods The Diamonsil C18 column （150mm×4.6mm,5μm） was used,and mobile phase was composed of CH3CN - C4H8O （25:15）and 0.1 mol/L of ammonium acetate solution,detection wavelength was at 235 nm; the flow rate was 1.0ml/min;column temperature was at 25℃。Results The content mensuration of three types of aconitine of aconite root in different period of harvest has chenged apparently,the content of hypaconitine appears to be decline tendency,instead,the content of mesaconitin and aconitine is ascent tendency from July to September.Conclusion This method is not only easy but also practical,it could be the evidence of further research of aconite root.
[Key words] Aconite root; Hypaconitine;Mesaconitin;Aconitine;HPLC
附子具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛之功效，为回阳救逆之要药[1].常用于大汗亡阳，吐泻厥逆，肢冷脉微，心腹冷痛，风寒湿痹，阳痿，宫冷，阳虚外感，阴疽疮疡以及一切沉寒痼冷之疾。现代研究表明，附子的主要化学成分除乌头类生物碱外，还有醇胺、脂类及多糖等。乌头碱是附子的有效成分同时也是毒性成分[2].为保证用药的安全有效，本文以附子为对象，以新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的含量为指标进行研究，比较不同采收期三种生物碱的含量差异。进而为附子质量评价和临床应用提供借鉴。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Aglient 1100高效液相色谱仪（自动进样器，四元泵，DAD检测器），HP1100/ WIND3D化学工作站；超声波清洗机（北京创新德超声电子研究所）；AE240电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。
1.2 试药
新乌头碱（批号：110799-200404,供含量测定用），次乌头碱（批号：110798-200404,供含量测定用），乌头碱（批号：0720-9807,供含量测定用），均购于中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯；水为乐百氏纯净水；其他试剂均为分析纯。
1.3 药材
附子药材均采自贵州龙里，经贵阳中医学院药学系贺祝英教授鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichahli Debx.的子根。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Diamonsil C18柱（150mm×4.6mm,5μm）；流动相A:乙腈-四氢呋喃（25:15）；流动相B:0.1mol/l醋酸铵溶液；洗脱程序见表1;检测波长：λ=235nm;流速：1ml/min;柱温：25℃；进样量10μl[3].表1 洗脱程序
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备
取新乌头碱、次乌头碱和乌头碱对照品适量，置25ml容量瓶中，加异丙醇-二氯甲烷（1:1）混合溶液制成浓度为（新乌头碱0.2820mg/ml,次乌头碱0.2817mg/ml,乌头碱0.0802mg/ml）的混合对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备
取本品粉末（过三号筛）约2g,精密称定，置具塞锥形瓶中，加氨试液3ml,精密加入异丙醇-乙酸乙酯（1:1）混合溶液50ml,称定重量，超声处理30min,放冷，再称定重量，用异丙醇-乙酸乙酯（1:1）混合溶液补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得[3].
2.2.3 阴性样品溶液的制备
按上述供试品溶液的制备方法，制备不含附子的阴性样品溶液。
2.3 系统适用性试验
分别取混合对照品溶液、供试品溶液及其阴性溶液各10μl,按“2.1”项下色谱条件进样。结果：阴性样品在新乌头碱、次乌头碱、乌头碱峰位置对应处无干扰峰出现。样品中三种乌头碱与其他成分完全分离，且分离度大于1.5.见图1.A阴性对照品；B混合对照品；C样品；1新乌头碱；2次乌头碱；3乌头碱图1 三种溶液高效液色谱图
2.4 线性关系考察
精密吸取混合对照品2、4、8、10、16、18μl,按“2.1”项下色谱条件进样。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算得新乌头碱回归方程为：Y=1225.9X+39.463,R2=0.9989;在0.56——5.08μg 范围内呈良好线性关系。次乌头碱回归方程为Y=1301.5X+18.581,R2=0.9996;在0.56——5.07μg范围内呈良好线性关系。乌头碱回归方程为1011.4X+46.369,R2=0.9989;在0.08——1.44μg范围内呈良好线性关系。
2.5 精密度试验
取“2.2”项下的对照品溶液10μl,按“2.1”项下色谱条件进样，重复测定6次。新乌头碱峰面积的RSD=0.51%;次乌头碱峰面积的RSD=0.76%;乌头碱峰面积的RSD=1.71%.结果表明，仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验
取“2.3”项下的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、10、12h进样，记录其峰面积。新乌头碱峰面积的RSD=1.55%,次乌头碱峰面积的RSD=1.08%,乌头碱峰面积的RSD=2.95%,结果表明供试品溶液在12h内稳定。
2.7 重复性试验
按“2.3”项下的方法，平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算含量。新乌头碱含量的RSD=2.05%,次乌头碱含量的RSD=1.34%,乌头碱含量的RSD=2.98%.结果表明此方法重复性良好。
2.8 加样回收试验
称取同一附子样品1.00g（精密称定），共9份。分别按高中低三个量加入新乌头碱、次乌头碱和乌头碱的对照品，按“2.3”项下的方法，制备供试品溶液。按“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果新乌头碱、次乌头碱、乌头碱的平均回收率分别为98.61%、97.52%、97.41% ;RSD分别为1.71%,1.64%、1.89%.
2.9 样品含量测定
精密称取不同采收时间的附子样品，按供试品溶液制备方法分别制备，按“2.1”项下色谱条件测定，计算含量。结果见表2.表2 附子样品含量测定
3 结果
分析测定结果表明，同一采收时间的附子中次乌头碱的含量最高，新乌头碱次之，乌头碱最低；不同采收时间的附子，随着时间（7 —— 9月份）的推移，新乌头碱的含量呈下降趋势，次乌头碱、乌头碱的含量呈上升趋势；三种生物碱的含量之和随采收时间呈上升趋势。然而不能单凭含量来确定附子的最佳采收期，因为附子的有效成分恰是其毒性成分，用得妙可救人于危难，反之可害人于顷刻之间。为了科学合理地采收和利用附子资源，确保临床用药的安全有效，还应与附子的毒性及临床疗效结合起来，综合分析，方能全面系统地评价“最有用亦最难用”的中药附子，本实验可为附子的进一步研究提供科学依据。
【参考文献】
1 黄兆胜。中药学。北京：人民卫生出版社，2002:225.
2 张智琳。浅析四逆汤类方治疗心力衰竭的特点。 中华中医药杂志，2005,2（4）：225-227.
3 国家药典委员会。中国药典，Ⅰ部。北京：化学工业出版社，2010:178.
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